動物造模 | 膿毒癥造模方法之CLP造模法

建立膿毒癥動物模型有哪些基本要求

建立膿毒癥動物模型必須從本質上模擬膿毒癥的病理生理機制，最新的膿毒癥的定義為宿主對感染產生的失控性反應，并出現危及生命的器官功能障礙的臨床綜合征。膿毒癥的本質上是最初的促炎爆發，接著代償性抗炎階段導致免疫抑制，當兩個階段相互補償時，患者存活率會提高。一個典型的膿毒癥模型應該經歷兩個不同的血流動力學階段，一個是最初的高排低阻階段，其特征是心輸出量降低，外周血管阻力增加，隨著膿毒癥的進展逐步進入低排低阻的階段；另一個是出現低血容量性休克，其特征是心輸出量降低，外周血管阻力也降低，因此心輸出量和外周血管阻力常常用來評價膿毒癥模型和臨床膿毒癥的相似性。

膿毒癥動物模型必須具備以下基本要素：

1. 有膿毒癥典型的高排低阻血流動力學表現和高代謝狀態；

2. 伴發多個器官功能障礙；

3. 有較高的自然死亡率，根據膿毒癥的轉歸，要求動物模型的自然死亡率達到50%～70%；

4. 膿毒癥是嚴重感染引起機體的炎癥反應過度激活造成的自身損傷，不是細菌和內毒素對機體的直接損傷，故出現器官功 能障礙及動物死亡距膿毒癥模型制備應有一定的時間間距。一般在制模后6～12 h 后發生的器官功能障礙或死亡屬全身炎癥反應所致。

實驗動物的選擇

在制作動物模型時多選用雄性小鼠，因為雌性小鼠較雄性小鼠更能耐受膿毒癥和失血性休克，且進入發情期的雌性小鼠性激素水平變化很大，而雄性小鼠在膿毒癥時更易于發生免疫抑制。

為什么選擇CLP模型？

盲腸結扎穿孔模型（CLP）模型是最接近于人類膿毒癥機制的模型，被稱為膿毒癥模型的“金標準”。CLP 技術在20世紀70年代被建立。CLP 模型非常適宜用于防治膿毒癥或膿毒性休克新藥的臨床前觀察 

造模方法

CLP膿毒癥模型的建立主要分為兩個階段：盲腸遠端結扎和盲腸穿刺。首先是手術引發的結扎部位組織變性壞死引起局部炎癥反應，其次是穿孔后使糞便內容物漏入腹膜引起多菌性細菌性腹膜炎，進而誘發全身性炎癥反應。

制作該模型的方法為大鼠腹腔麻醉消毒后選取腹部正中切口打開腹腔長約 2 cm，尋找盲腸，小心分離其遠端與大腸的系膜，在盲腸遠端 1/2 處用無菌4 號絲線緊緊結扎，并用無菌7號針頭在已結扎盲腸遠端中央處貫通穿刺，然后把盲腸推回腹腔，關閉腹腔。  

影響因素

多數研究一致認為盲腸結扎位置是CLP模型中死亡率和疾病嚴重程度的最主要決定因素。結論為：① 結扎25%或以下的盲腸死亡率幾乎為零，為輕度膿毒癥；② 結扎50%～60%的盲腸導致術后死亡率為60%，為中度膿毒癥；③ 結扎75%或以上的盲腸導致小鼠在術后2～3 d內全部死亡，為重度膿毒癥。而在不同程度膿毒癥中，死亡主要集中在最初的48 h內。

有研究通過改變盲腸結扎位置和穿刺針直徑來調節膿毒癥的嚴重程度，其中提到與結扎長度小于1 cm的小鼠相比，結扎長度超過1 cm的小鼠死亡率顯著增加至100%；增加穿刺針的直徑也使得存活率從100%（22G針）降低至55%（19G針）。結論為：在上述兩個因素中，盲腸結扎位置比針頭大小影響更為顯著。

CLP誘導的膿毒癥術后6 h即可出現菌血癥，術后約12 h出現膿毒癥相關臨床癥狀，包括發熱、寒戰、毛發豎立、全身無力和活動減少等，術后18 h開始死亡?？傊?，在制作CLP模型時，必須仔細考慮所有可能影響實驗的條件和技術參數以獲得可重復且一致的實驗結果。因此，要求實驗人員深入了解和熟練掌握操作過程才能準確地構建CLP模型。             

造模評價

該模型通過模型動物自身感染引發膿毒癥，與臨床膿毒癥類似的地方在于有連續分散的細菌感染源，血中內毒素檢出率及細菌培養陽性率高，動物體溫降低以及血流動力學早期高排低阻晚期低排低阻的特征也與臨床相仿，在建模的同時模擬臨床膿毒癥治療方法，輔以充分的液體復蘇和適當輔助治療(如抗菌藥物治療)，另外這個模型可控性高，標準化水平高。該模型中膿毒癥的嚴重程度受 3 個重要因素的影響：結扎盲腸的長度、穿孔針的大小和 CLP 后的支持治療。結扎盲腸的長度是死亡率的主要決定因素，隨著結扎盲腸的長度的增加，促炎細胞因子的水平也在增加。

來源：

[1]李晗,田李均,韓旭東.膿毒癥體內外模型研究進展.中國感染與化療雜志,

2020,20(01):102-106.DOI:10.16718/j.1009-7708.2020.01.019.

[2]彭鳳輝,鄧曉彬,呂立文.膿毒癥動物模型的研究進展.廣西醫科大學學報,

2020,37(08):1577-1581.DOI:10.16190/j.cnki.45-1211/r.2020.08.031.

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