實驗干貨 | 分子克隆實驗——無縫克隆

無縫克隆的原理：

在載體末端和引物末端應具有15-25個同源堿基（同源臂）。通過T5核酸外切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶，三種酶同時發揮功能，從而達到單片段或多片段與載體連接的技術。

T5核酸外切酶：5‘→3’端消化DNA片段，

形成粘性末端；DNA聚合酶：填補缺口；

DNA連接酶：兩條DNA 單鏈黏合起來。

無縫克隆的特點

傳統分子克隆

無縫克隆

傳統分子克隆和無縫克隆對比：

• 單次插入片段：傳統分子克隆一輪只能插入一個片段；無縫克隆單個至多個（≤5）。
• 受限于酶切位點：傳統分子克隆是；無縫克隆不是。
• 引入多余序列：傳統分子克隆是；無縫克隆不是。
• 流程&操作時間：傳統分子克隆流程繁瑣，時間長。
• 無縫克隆流程簡單，時間短。
• 克隆效率：傳統分子克隆較低；無縫克隆單片段≥95%。

實驗流程

1.載體制備

載體的線性化：酶切（單酶切、雙酶切）或反向 PCR 擴增。

① 酶切制備

使用限制性內切酶進行載體線性化時，推薦使用雙酶切方法進行，其次是單酶切。

注意:

 1：經雙酶切進行線性化的載體無需去磷酸化，經單酶切則需要去磷酸化；

 2：酶切完成后，應將快速內切酶失活或將目的產物進行純化后再用于重組反應。

② 反向 PCR 擴增制備

載體末端引物設計：

反向 PCR 擴增制備線性化載體需要使用的引物；

為了減少擴增突變的引入，推薦使用高保真 PCR Mix 進行擴增，推薦使用預線性化的質粒作為模板，以減少環狀質粒模板殘留對克隆陽性率的影響。

注意：以環狀質粒為模板時，PCR 產物需要使用 DpnI 等甲基化敏感型限制性內切酶對擴增產物進行處理，或對產物進行膠回收純化。

2.插入片段制備

引物設計原則：

通常使用PCR擴增的方法來獲得目的片段，PCR 引物的5' 端必須包含與其相鄰片段（插入片段或載體）末端同源的15~25nt（推薦 18 nt）序列 , 以保證擴增產物的5' 端和3' 端分別與相鄰片段形成重疊序列。目的片段 PCR 引物包括：載體與插入片段連接處引物、插入片段與片段連接處引物。

插入片段正向擴增引物： 

5' —上游載體末端正向同源序列+酶切位點（可選）+ 基因特異性正向擴增序列—3’

插入片段反向擴增引物：

3‘ —基因特異性反向擴增序列 + 酶切位點（可選）+ 下游載體末端反向同源序列—5’

載體與插入片段、插入片段與片段連接處引物、載體反向擴增引物設計

制作最終序列圖譜

引物設計工具

1.在線設計

2.SnapGene軟件更加專業，這款軟件用來繪制圖譜，編輯序列，設計引物，重組克隆都非常方便

3.無縫克隆

1、體系配制；

a. 最適載體用量（ng） = 0.02 × 載體堿基對數，即 0.03 pmol（單片段、多片段適用）； 

b. 最適片段用量（ng）= 0.04 × 片段堿基對數（單片段）；最適片段用量（ng）= 0.02 × 片段堿基對數（多片段）。 

注1：單片段重組反應，若單個插入片段的長度大于載體，則應將載體與插入片段的計算公式互換； 

注2：單片段重組反應，若單個插入片段的長度小于200bp，則插入片段應使用 5 倍的用量； 

注3：多片段重組反應，各個插入片段的用量應不少于10ng，使用上述公式計算最適使用量低于此值時， 直接使用 10ng； 

注4：若按上述公式計算出的線性化載體用量低于50ng 或高于200ng，建議按50ng或 200ng用量使用； 

注5：線性化載體過長，插入片段過長或片段數過多，克隆陽性率均會降低。

2、體系反應；

1、配制完成后，用移液器輕輕吸打混勻各組分，避免產生氣泡，切勿渦旋；

2、將反應體系置于50℃，反應5~60min。

3、將反應液離心管置于冰上冷卻，之后進行轉化或者儲存于-20℃

注1：推薦使用PCR儀等溫控精準的儀器進行反應，反應時間不足或太長克隆效率均會降低； 

注2：插入1~2個片段時，推薦反應時間為5~1 min；插入3~5個片段時，推薦反應時間為15~30min； 

注3：當載體骨架在10kb以上或插入片段總長在4kb以上時，推薦延長反應時間至30~60min； 

注4：建議在50℃反應完成后進行瞬時離心，將反應液收集至管底。

注5：-20℃ 儲存的重組產物，建議1周內使用完畢。

4.轉化

① 將克隆用的化學感受態細胞置于冰上解凍；

② 取 5~10μl重組產物反應液，加入到100μl感受態細胞中，緩慢吸打混勻，冰上放置30 min；

③ 42℃熱激 45~60 sec，冰浴5min；

④ 加500μlSOC或LB培養基，37℃振蕩培養40~60min（200rpm）；

⑤ 將菌液均勻涂布在含有對應抗生素的平板上，倒置于37℃過夜培養。

注 1：推薦使用轉化效率>108CFU/μg的感受態細胞；

注 2：菌落數取決于PCR產物與線性化載體的數量和純度。