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    動物實驗這些取樣細節,你有注意嗎?

    發布時間:2023-07-27

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    實驗樣本分類

    實驗一般采取樣本有:血液樣本、組織樣本和細胞樣本。

    通常,組織樣本采集后,應立即用等滲溶液(PBS或生理鹽水)盡量把血液漂洗干凈(除非血液也是分析對象),用濾紙或紗布吸干,把樣本分切成幾分,每份的體積約2個黃豆大小,每份用一個管子裝。

    血液樣本的采集應根據不同實驗的要求,將會采取不同策略。

    血清樣本:全血中不加抗凝劑,血液凝固后取出的不含凝血因子的淡黃色透明液體。(全血標本室溫放置2小時3000rpm/min離心15min)

    血漿樣本:全血中加抗凝劑,血液凝固后取出的含凝血因子的淡黃色透明液體。(可用EDTA或肝素作為抗凝劑,標本采集后30分鐘內于2-8℃,3000rpm/min離心15min)

    • 如果是做生化\ELISA等檢測可以考慮血漿和血清,根據獲得的樣本量可考慮分裝成100-500μl/管,可避免反復凍融造成的檢測誤差。

    生化:建議優先選擇血清,其次選擇肝素抗凝血漿;

    ELISA:建議優先選擇血清,其次選擇肝素或EDTA抗凝血漿;

    凝血實驗:只能選擇枸櫞酸鈉抗凝血漿;

    血常規:只能選擇EDTA抗凝全血;

    • 如果要收集其中的白細胞、血小板等建議用抗凝全血。

    • 如果要做流式建議用專門的流式用血液收集管,防止表面抗原的丟失,或者盡快安排就近檢測。


    樣本處理

    取樣完后,應根據所檢測指標的要求,需采取不同策略處理。

    在如今分子生物學當道的現實背景下,動物實驗除了對實驗動物的體征及生理指標進行全方位的監控外,各種分子檢測甚至是組學檢測也開始大行其道,動物實驗結束之后的機制研究成為了實驗的重頭戲。

    一般來說,動物實驗檢測對象主要包括:


    (1)體液中各類因子定性及定量檢測

    由于此類檢測對象多為蛋白及各類小分子物質,因此在取樣過程中應注意防止此類物質降解,在獲取后,應及時置于超低溫(≤-80℃)進行保存,在后續實驗過程中,也應當注意保存條件的穩定性,避免反復凍融。

    最常用的方法便是酶聯免疫吸附測定(ELISA),除此之外,可利用生化分析儀及不同檢測方法的試劑盒(比色法、比濁法等)方法對各類生化指標及因子進行定性及定量檢測。


    (2)組織器官病理、生理變化及免疫組化檢測

    常用的病理檢測多使用H&E染色對細胞質及細胞核進行染色標記,以觀察細胞變化。除此之外,許多特殊染色也在病理生理變化中得到了廣泛應用,如利用Masson染色檢測組織纖維化病變,Nissl染色檢測神經元損傷,β-半乳糖甘酶染色檢測細胞衰老等。

    此外,還可以通過免疫組化技術對某些特異性標記物進行免疫顯色檢測,達到原位定性或定量檢測的目的。


    (3)基因/蛋白質表達定性或定量檢測

    在進行分子檢測的過程中,保持核酸和蛋白質的完整性至關重要,因此在取樣過程中,應盡量避免核酸及蛋白質的降解。如不注意采樣過程,將會導致樣本中的核酸及蛋白質的無差別降解,嚴重影響后續分子檢測結果。

    • 在條件允許的情況下,組織樣本在離體后應立刻裝入凍存管內,并立即放入液氮中進行冷凍。
    • 在RNA提取樣本的保存過程中,可以選擇非冷凍型RNA保存液或Trizol試劑進行RNA酶的抑制。
    • 針對蛋白質提取樣本的保存,我們同樣可以使用商品化的蛋白酶抑制劑進行短期處理。

    聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)及免疫印跡(Western blotting,WB),這兩種實驗手段是分子生物學檢測中不可或缺的一部分,也是發表論文至關重要的分子檢測數據。PCR主要用來對基因在基因組層面或轉錄層面的變化進行定性或定量檢測,而WB則主要用來對某一蛋白質的表達進行定量檢測。


    (4)轉錄組學、蛋白質組學及代謝組學檢測

    隨著檢測水平及相關產業的不斷發展,各類組學檢測的價格大大降低,實驗設計中也常常運用組學檢測來提升實驗設計的檔次。在我們進行轉錄組學及蛋白質組學的檢測過程中,同樣是要首先確保目標RNA或蛋白質的片段完整性。

    代謝組學的研究對象大都是相對分子量在1000以內的小分子物質,因此常用的血液樣本在取樣后,應小心操作,防止溶血,盡快分離出血清,分置于超低溫環境下保存。

    由于用于病理實驗的動物組織采集相對其他樣品的采集,操作更繁瑣,在處理過程中許多細節容易忽略,造成數據不完美(甚至不能用)。因此接下來將重點介紹組織樣品采集的注意事項及其固定。


    組織樣品采集注意事項

    1. 組織應新鮮,操作時間盡可能短,否則細胞發生死后變化、自融及腐敗現象。最好是動物心臟還在跳動時采集,樣本取出后最好在5分鐘以內置于固定液內,避免長時間暴露在空氣環境中。
    2. 組織塊盡量小而薄。組織塊的厚度以不超過5mm為宜,較為理想的厚度為2mm左右,主要目的是使固定液迅速而均勻的滲入組織塊內部。
    3. 勿使組織塊受擠壓。在采集過程中,應盡量選擇較為鋒利的手術器械,如手術專用刀片等,避免操作過程中擠壓挫傷標本。擠壓過的組織均不可用。固定液的量一般以組織塊大小的20倍為宜,組織能夠在容器內自由移動最佳。
    4. 盡量保持組織的原有形態。新鮮組織經固定后,或多或少產生收縮現象(如胃腸),為此可將組織展平,以盡可能維持原形。
    5. 保持組織清潔。組織塊上如有血液、污物、粘液、食物、糞便等,可用生理鹽水沖洗,然后再入固定液,但要注意防止組織損傷。
    6. 要熟悉采集部位。要能準確的按解剖部位采集,如胰腺,一般取胰島較多的胰腺尾部;肺應取有細支氣管及帶有軟骨片的小支氣管部。如果實驗需進行多組織樣本的采集,采集順序應按照:消化器官,神經系統器官,皮膚,肌肉等的順序進行。
    7. 選好組織塊的切面。熟悉某些器官組織成分安排,然后決定其切面的走向;如一長管狀器官以橫切面較好。
    8. 切除不需要的部分。特別是組織周圍的脂肪等,應盡可能清除掉,否則給固定、脫水、浸蠟、切片等帶來一些不必要的問題。


    組織樣品的固定

    (1)固定的方法:

    ①小塊組織固定法:從動物取下的小塊組織,立即置入液態固定劑(這是應用最廣泛最經常的方法)。

    ②注射/灌注固定法:某些組織塊由于體積過大或固定液極難滲入內部或需要對整個臟器或整個動物進行固定,這時宜采用注射固定法,將固定液注入血管,經血管分支到達整個組織和全身,從而得到充分的固定。

    另,空腔組織比如肺,肺內含有空氣,固定液難以滲入,建議先做肺灌注,使得肺充盈滿固定液以后再進行保存,如果空腔中氣體沒有有效排出,后續可能影響固定效果(沒有灌注的肺組織會浮在液體表面不利于固定,切片以后也會看到很多的空泡)。

    ③蒸汽固定法:比較細小而薄的標本,可用鋨酸或甲醛蒸汽固定。主要用于血液或細胞涂片以及某些薄膜組織的固定。


    (2)固定的目的

    ①保持其原有狀態:使細胞內的蛋白質、脂肪、糖、酶等成分轉變為不溶性物質,迅速防止組織、細胞的死后變化,防止自溶與腐敗,防止細胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態結構,使之盡量保持生前的狀態和結構。

    ②以便染色后易于鑒別和觀察:不同組織成分對染料有不同的親和力,以便染色后易于鑒別和觀察。

    ③使組織塊硬化,便于制作薄片(組織塊在脫水、包埋、切片、染色等過程中不易損壞)。


    (3)固定液

    固定液種類:一類是單純固定液,即只有一種試劑;另一類是混合固定液,由兩種或兩種以上試劑組成。

    作為較好的固定液,應有下列特性,首先,有強滲透力,能迅速的滲入組織內部;其次,不使組織過度收縮或膨脹,并能使組織內欲觀察的成分得以凝固為不溶性物質;最后,能使組織達到一定的硬度并獲得較佳的折光率和對某些染料具有較強的親和力。

    固定液通常使用10%的甲醛溶液。特殊要求的組織,常需要特殊的固定液,取樣之前應做好準備。如眼球樣本應使用FAS眼球固定液,脂肪組織應使用脂肪組織專用固定液等。此外,在進行骨組織樣本制備的時候,還應注意提前進行脫鈣處理,可根據具體情況選擇慢脫鈣或快脫鈣處理。

    總的來說,樣品的采集是實驗中至關重要的一環,如果取樣環節出現了偏差,往往會導致后續檢測結果的偏移,稍有不慎便前功盡棄。而清晰把握了不同檢測實驗的檢測對象,并根據其特性采取不同的采樣策略,搭配各種輔助工具及試劑,往往能夠事半功倍,輕松完成實驗。

    最后,在采樣過程中,應據實驗動物福利倫理,在實驗過程中盡量減少動物的痛苦,盡最大努力善待它們。

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